液质联用进行菠菜中残留农药检测

摘要本应用方法介绍了一种简单、快捷、廉价、有效、耐用、安全的(QuEChERS) EN 样品制备方法及其应用，该方法可用于菠菜中 13 种具代表性的不同种类残留农药的萃取和净化。菠菜被认为是一种高色素基质，而用于高色素瓜果和蔬菜的 EN 分散固相萃取试剂盒是有选择性的。试剂盒中将添加了 7.5 mg/mL 石墨化碳黑（GCB）的乙腈萃取剂。通过液相色谱和电喷离子化串联质谱仪联用（LC-ESI-MS/MS），正离子模式多重反应监测模式（MRM）测定菠菜萃取物中的残留农药。通常认为 GCB 对平面结构的农药萃取有显著的负影响。但是，本文研究结果显示在 EN 分散固相萃取试剂盒中添加少量 GCB 时对平面结构农药的影响可以忽略，所得定量结果也是可以接受。本指南给出的菠菜中农药的定量限（LOQ）为 5 ng/g，大大低于最高允许残留（MRL）。回收试验的加标水平分别为 10、20、200 ng/g，表明回收率在 60%-99%范围内（平均 85.4%），相对标准偏差低于11%（平均 5.5%）。

引言EN QuEChERS 方法被广泛的用于食品中的农药分析，特别是在欧洲。该方法采用乙腈作萃取剂，然后通过利用氯化钠和柠檬酸盐缓冲液从样品中的盐析出水来诱导液-液分层。为了净化的需要，采用了分散固相萃取步骤，结合乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)的使用以除去脂肪酸及其它组分，则用来吸收萃取物中的残留水。根据不同的食物基质，该步骤中可能会增加其它成分，如用于除去色素和甾醇的石墨化炭黑（GCB）或者用于除去更多类脂和脂肪油的 C18 等。由于含有高浓度的叶绿素，菠菜被认为是一种高色素蔬菜。因此，本应用选用适用于高色素量商品的 EN 分散固相萃取试剂盒。在这些试剂盒中，除了 25 毫克 PSA 和 150 毫克 MgSO4 外，每毫升乙腈萃取剂中还加入了 7.5 毫克 GCB。GCB 可以吸附平面分子如色素和甾醇，因此它对于净化色素基质如菠菜是非常有帮助的。GCB 添加量越大，平面分子吸收得越多，可得到更干净基质的样品。EN 法和 AOAC 法在净化高色素基质方面的主要区别是在分散固相萃取步骤中 GCB 添加量不同是。AOAC 法中 GCB 的添加量较高（每毫升乙腈萃取剂中添加 5 毫克 GCB），EN 法中 GCB的添加量较低 (处理“有色”产品时，每毫升乙腈萃取剂中添加2.5 毫克 GCB；处理“深色”产品时，每毫升乙腈萃取剂中添加7.5 毫克 GCB)。GCB 对平面农药萃取的影响随所用方法的不同而有所区别。AOAC 法可制得基质更干净的样品，但是易造成平面农药分子的大量损失；与此相反，EN 法造成的平面农药分子损失较少，但样品基质更为复杂。

之前，我们曾介绍过一种改进的 AOAC 法，即在分散固相萃取中添加甲苯可明显提高高色素基质（如菠菜）中平面结构农药的萃取效率[3]。随后，我们采用原始 AOAC 法（不含甲苯）和改进的AOAC 法（添加甲苯）相结合阐明了 Bond Elut QuEChERS AOAC试剂盒在菠菜中农药残留分析方面的性能[4, 5]。在这项研究中，采用 13 种农药评价了安捷伦 EN 缓冲萃取剂(部件号 5982 - 5650)和Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取试剂盒在高色素水果和蔬菜(部件号 5982-5321 和 5982-5356)分析中的性能。也验证了该方法的重现性和回收率也。表 1 是菠菜中各种农药的化学和法规信息。

实验部分药品和试剂所用试剂和溶剂均为高效液相纯级或分析纯级。甲醇和甲苯购自霍尼韦尔（美国，马斯基根）。乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)、冰醋酸(HAc)购自 Sigma- Aldrich 公司（美国，密苏里州圣路易斯）。醋酸铵(NH4OAc)购自费舍尔化工(美国，新泽西，Fair Lawn)。甲酸(FA)购自 Fluka(德国，Sleinheim)。农药标准品和内标物（磷酸三苯酯，TPP）分别购自 Sigma- Aldrich 公司（美国密苏里州圣路易斯）、Chem Service 公司（美国宾夕法尼亚州西切斯特）、Ultra Scientific 公司（美国罗得岛州北金斯敦）或 AlfaAesar (美国，马萨诸塞州，Ward Hill)。溶液及标准品将 19.27 克 NH4OAc 粉末溶解在 250 mLMilli-Q 超纯水中，用 PH计监控，采用乙酸调溶液 PH 值到 5，得到 PH=5 的 1M 醋酸铵原液，并于 4 ºC 保存。将 200mL MeOH 与 800mL Milli-Q 超纯水混合，加入 5mL PH=5 的 1M 醋酸铵原液，混合均匀，得到MeOH/H2O=20：80、PH=5 的 5 mM 醋酸铵溶液。向 1L 乙腈中加入 5mLPH=5 的 1 M 醋酸铵原液，均匀混合后超声 5 min，即得5 mM 醋酸铵乙腈溶液。1%甲酸的乙腈溶液可通过 100 mL 乙腈与1 mL 甲酸混合均匀得到。标准品和内标物（IS）储备液(除多菌灵为 0.5 mg/ mL 外，其余均为 2.0 mg/ mL)分别用 MeOH，含 0.1 %甲酸溶液的乙腈或 DMSO配制，于-20 ºC 下低温储存。1、5、20 µg/mL 的三种 QC 加标溶液以乙腈和 0.1%甲酸溶液的水 1:1 混合作基质，现配现用。制备10 µg/mL 标准品的乙腈/水（含 0.1% FA）=1:1 的加标溶液，并通过适当稀释，用于获得空白基质加标标准曲线。以含 0.1%甲酸溶液的 1:1 乙腈/H2O 为溶剂，制备 15 µg/mL 的 TPP 加标溶液。

仪器和材料Agilent 1200 Series HPLC with Diode Array Detector (AgilentTechnologies Inc., CA, USA)配备二极管阵列检测器的 Agilent 1200 系列高效液相色谱系统（美国，加州，安捷伦科技有限公司）配置电喷雾离子源的 Agilent 6410 三重串联四级杆 LC / MS 系统（美国，加州，安捷伦科技有限公司）Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取试剂盒，部件号 5982-5650和用于高色素水果和蔬菜的 Bond Elut QuEChERS EN 分散固相萃取试剂盒，部件号 5982 - 5321 和 5982- 5356（安捷伦科技有限公司，德州，美国)CentraCL3R 离心机（美国马萨诸塞州 Thermo IEC）瓶口移液器（美国新泽西州，So Painfield，VWR）Eppendorf 微型离心机（美国纽约，Westbury，Brinkmann 仪器公司）

仪器条件LC/MS/MS 法如前所述[9]液相色谱条件色谱柱： Agilent ZORBAX 溶剂节省 Plus Eclipse Plus苯基-己基柱，3.0 x 150 mm, 3.5 µm（部件号 959963-312)流速： 0.3 mL/min柱温： 30 ºC进样量： 10 µL流动相： A, PH=5 的 5 mM 乙酸铵 MeOH/H2O=20:80 溶液；B, PH=5 的 5mM 乙酸铵乙腈溶液洗针液： 1:1:1:1 乙腈/甲醇/异丙醇/水含 0.2%甲酸梯度： 流速时间 % 乙腈 (mL/min)0 20 0.30.5 20 0.38.0 100 0.310.0 100 0.313.0 停止后运行： 4 分钟总分析时间： 17 分钟质谱条件正离子模式气体温度： 350 ºC气体流速： 10 升/分雾化气： 40 Psi毛细管电压： 4000V分析物相关的其他条件列于表 2。

样品制备样品制备过程包括样品粉碎，萃取/分离和分散固相萃取净化等步骤，这在早期的应用指南上有详细的描述。[9]菠菜样品处理过程与苹果样品处理过程很相似，但与一般的水果和蔬菜样品处理相比，菠菜样品处理的分散固相萃试剂盒适用于高色素量产品分析。简单来说，首先将冻存的有机菠菜匀浆。取 10 克（±0.1 克）匀浆后的样品放入 50 毫升离心管中。如需要，可先通过适当的QC 加标溶液(100 µL)对样品进行加标，然后加入 66.7 µL IS 加标溶液（15 µg/mL 的 TPP）。涡旋 30 秒，每个样品管中加 10 mL 乙腈，盖紧样品管盖，振摇 1 分钟。每一个离心管中直接加入Agilent Bond Elut QuEChERS EN 萃取盐包(部件号 5982-5650)、1 g 氯化钠、1 g 柠檬酸钠，0.5 g 柠檬酸氢钠半水合物。盖好管，用力振摇 1 分钟，于 4000 rpm 离心 5 分钟。1 mL 上层乙腈层转入安捷伦分散型固相萃取柱的 2 mL 管中（部件号 5982-5321）；或 6 mL 上清液转入安捷伦分散型固相萃取柱的 15 mL 管中（部件号 5982-5356 ）。2 mL 的管中含有 25 mgPSA， 7.5 mg GCB，而 15 mL 管中则含有150 mg PSA， 45 mg GCB。盖紧管，用力摇 1 分钟。将 2 mL 管 放入微 型离心 机中 13000 rpm 离心2 min，15 mL 管在标准离心机以 4000 rpm 离心 5 min。取 200 µL等份的萃取液转移到进样瓶中，立即加入 10 µL 1% 甲酸的乙腈溶液。然后加入 800 µL 水或者适量的标准品溶液（制备成水溶液）。盖紧样品管，涡旋混匀，以备 LC/MS/MS 分

结果与讨论QuEChERS 方法为农药残留分析提供了获得高质量结果的快速、简便而廉价的方法。对于含色素的水果和蔬菜，在分散型固相萃取管中添加石墨化碳黑（GCB）可以提高色素和甾醇的清除效率。清除效率与 GCB 的加入量有关。添加 GCB 的量越多，处理后的基质就会越干净，最终样品中的基质干扰就越少。由于 GCB 也可能导致萃取过程中的平面结构农药分子的清除，所以在 EN 分散固相萃取步骤中使用了非常少量的 GCB。与 AOAC 方法相比，用于色素性物质的 EN 方法在分散固相萃取步骤中使用了非常少量的 GCB。对于像胡萝卜、生菜这样的普通色素性商品，每毫升乙腈萃取剂中添加 2.5 mg 的 GCB；对于高色素性商品如菠菜和红甜椒，每毫升乙腈萃取剂中则需要添加 7.5 mg 的 GCB。[1]根据建议，我们研究中采用适用于高色素产品的 EN 分散萃取试剂盒。由于采用高色素试剂盒，EN 方法中的 GCB 用量仍然比AOAC 方法低得多，每 mL 乙腈萃取剂中只需添加 50 mg GCB。所以，很明显，EN 方法中的基质净化效率要比 AOAC 法弱得多。通过 EN 方法处理得到的样品仍然呈现深绿色，而先前经过AOAC 法处理后的样品几乎呈无色透明状。空白基质的紫外色谱（l= 254 nm）也有差异，如图 1 所示。EN 法处理的空白基质中干扰峰更多，而且更多的杂质在色谱柱或离子源处累积，可能对色谱柱及质谱仪造成不利影响。然而，由于 LC/MS/MS 提供了选择性，空白基质的 MRM 色谱图并没有显示任何目标分析物的干扰峰。图 2 显示了空白基质（添加内标物）和 50 ng/g 经过 EN 分散萃取法处理的加标菠菜萃取物的 LC/MS/MS 色谱图。4 种农药包括多菌灵、噻菌灵、嘧菌环胺和吡蚜酮，由于具有平面结构，在经过原来的 AOAC 分散固相萃取方法处理时明显损失。而在固相萃取步骤中，添加甲苯改进该方法可以提高萃取效率[3,4]。为了研究 GCB 对于平面结构农药的影响，我们比较了固相萃取步骤中分别添加和不添加甲苯时，对相同农药标准品（50ng/g）水平加标的菠菜样品萃取效果。结果表明，在 EN 法中GCB 的使用量比较少时，平面农药很少或没有损失，加入甲苯没有明显改善。因此，后续实验采用了原始的 EN 方法。也考察了该方法的回收率和重现性，还对定量结果进行了讨论。