液相色谱/质谱/质谱方法测定牛尿中的 20-羟基蜕皮酮及代谢物

摘要蜕化类固醇(Ecdysteroids)，是存在于无脊椎动物和植物中的甾体激素，它可能被用于饲料中的蛋白同化制剂。蜕化类固醇的滥用控制依赖于生物基质样品中微量（µg.L-1）激素有效检测方法的建立。本文介绍了双固相萃取柱(C18 和 SiOH)前处理和液相/电喷雾-质谱/质谱技术测定尿样中 20-羟基-蜕化素及代谢物的分析方法。串联质谱的高灵敏度和特定性特别适合内标样品和阳性样品中的痕量激素成份。所有被检测的化合物，在 0.12 ng至 12 ng 柱上量范围内，具有良好的线性。

前言蜕化类固醇(Ecdysteroids)，是存在于无脊椎动物（主要是节肢动物）和植物（菊科植物，石竹科及水龙骨科）中的甾体激素。对于菊科植物，蜕化类固醇的作用是脱毛，而这些分子被认为是保护植物防止非适应性的食素昆虫的侵袭。原型蜕化类固醇是 20-羟基蜕化素。几项表明它对动物（鼠、猫和日本鹌鹑）包括禽畜和人具有促生长作用[1-3]。临床研究表明 20-羟基-蜕化素比美雄酮（methandrostanolone ）具有更强的蛋白同化作用，而且传统激素的雄化或其它副作用[4]。然而，尽管它们具有生长促进作用，但是只有少数的方法用于生物样品中 20-羟基-蜕化素的检测，而且对于其代谢物在禽畜中的有关信息没有报道[5]。在本应用中，建立了一种可以定性和定量牛尿中痕量水平(ppb)20-羟基-蜕化素及代谢物的分析方法[6]。此方法可以用于牛服用 20-羟基-蜕化素之后，在牛尿样品中 20-羟基-蜕化素的含量及药物在体内去除的动力学的研究。

实验部分Compound Standards22S-23S-高油菜素内酯（属于油菜素类固醇，一种蔬菜类固醇），购自 Sigma-Aldrich；20-羟基蜕化素、14-去羟基、20-羟基蜕化素、20，26-二羟基蜕化素来自 Lafont 教授的友好支持。样品前处理25 毫克的 22S，23S-高油菜素内酯作为内标物（IS），加入到牛尿样品中，在 3500 转下离心 15 分钟，然后用 C18 固相萃取柱净化。固相萃取柱分别用 10 毫升甲醇、10 毫升水活化，然后上样。分别用 6 毫升水/甲醇（80/20）淋洗固相萃取柱，蜕化类固醇用10 毫升甲醇被洗脱出来。被收集的洗脱液在氮气流下吹干。用50 微升乙醇和 150 微升环己烷溶解。然后用 SiOH 固相萃取柱进行进一步净化（之前用 25 毫升环己烷活化）。用 6 毫升乙酸乙酯/环己烷（80/20），目标化合物用 10 毫升氯仿/甲醇/丙酮（6/2/1）洗脱出来。洗脱液用氮气吹干，再溶于 50 微升甲醇/0.5% 醋酸水溶液（30/70）。10 微升样品进入液质联用仪。

仪器液相色谱：色谱柱： GEMINI C18, Phenomenex(3 µm, 110 Å, 50 × 2 mm)/Agilentequivalent: ZORBAX Extend-C18 3.5 µm,2.1 mm × 50 mm (p/n 735700-902)柱温： 40 °C流动相： A: MeOHB: 0.5% 醋酸水溶液流速： 0.3 mL/min梯度： Time (min) %B0 908 010 012 9016 90进样量： 10 µL质谱： G 6410A QQQ, Agilent Technologies离子化模式： ESI (+)碰撞电压： 120 V质量范围： 100–500 amu驻留时间： 300 ms毛细管电压： 4000 V雾化器压力： 35 psi干燥气流速： 11 L/min干燥气温度： 325 °C每个目标化合物的多反应参数见表 1。第一个离子是响应强的离子。

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为了评价方法的特定性，空白尿样添加 1 µg.L-1 的 20-羟基蜕化素。图 2 显示了空白样品的分析结果，在 20E 的位置没有任何干扰峰，表明分析方法具有优异的选择性。使用多反应监测模式分析添加20-羟基蜕化素的样品。结果表明本方法具有优异的灵敏度和很好的信噪比。分析结果满足欧盟 2002/657 的要求，此欧盟要求要求更多的鉴定点以提高确定度[7]。利用添加五个不同浓度（0.2 ng.mL-1、0.5 ng.mL-1、1 ng.mL-1、5 ng.mL-1 和 20 ng.mL-1)的尿样进行线性和重现性的评价。校正曲线的线性回归系数优于(R2)0.99，结果显示 20-羟基蜕化素具有优异的线性。本方法成功地用于牛在服用 20-羟基蜕化素之后的尿中的激素的浓度水平，一共分析了四天的样品。在服药 30 分钟之后就检测到尿中含有 20-羟基蜕皮酮，而且浓度水平在 24 小时内持续上升。20-羟基蜕化素有两个代谢物，分别是 14-去羟基、20 羟基蜕皮酮(M1)和 20，26-二羟基蜕皮酮(M2)[8]。表 1 中是 LC/MS/MS 分析两个代谢物的参数。图 3 是 14-去羟基、20 羟基蜕皮酮(M1)在服药之前和两天之后的尿样的分析结果。结果表明，服药之前没有检测出 M1，服药之后的四天还可以检测出 M1。根据四个鉴定点的分析原则，在服药两天之后，还依然可以检测 M1。由于在服药后可以长期检测出 M1，因此可以监测蜕化类固醇的误用或滥用。

结论本方法的分析结果表明液相色谱/质谱/质谱技术是能够有效验证尿样中 20-羟基蜕化素及两个代谢物。这些化合物可以被用于动物是否发生 20-羟基蜕化素的误用或滥用的监测和控制。串联四极杆液质联用仪的多反应监测功能大大提高化合物的定量和确认可信度，满足欧盟 2002/657/EC 决议的规定。牛尿样品的成功检测建立了可靠的分析操作流程。本方法学也可以用于牛尿中20-羟基蜕化素主要代谢物的一级消除动力学研究。