高通量色谱柱对甘草提取物进行高分离度反相 HPLC 分析

前言药用甘草取自生长在欧洲、中东和西亚的高约 4、5 英尺的灌木植物光果甘草（Glycyrrhiza glabra）的根部。已知该植物的根含有约 4%的甘草甜素，即甘草酸的钾盐或钙盐。甘草酸为带两分子葡萄糖醛酸的五环三萜羧酸（18-ß-甘草次酸）的糖苷（图 1）。甘草甜素比蔗糖甜 50 倍，但已知大剂量时有毒。水解后糖苷失去甜味，转化为甘草次酸苷元和两分子葡萄糖醛酸。使用长的 1.8 µm 快速分离高通量色谱柱对甘草提取物进行高分离度反相 HPLC 分析应用报告任何品种甘草的萃取物都包含 100 多种化合物。其中的几种被用作糖果中的甜味剂、止咳tang浆中的调味剂，以及在药物中用来掩盖苦味，而中草药（TCM）主要利用其治疗效用。甘草的治疗效用早在几个世纪前就被中国、印度、埃及、希腊和罗马所知。其用途包括止咳剂、泻药，还可用于治疗胃溃疡、阿狄森氏病和肝病。近来，已证明甘草甜素有对抗 DNA 和 RNA病毒（流感病毒 A 和 B、HIV、VZV 和 B 型和 C 型肝炎病毒）的抗病毒活性[1]。甘草也用于外用化妆品。

甘草种类不同、采收时间不同、提取方法不同都会使目标化合物的丰度发生很大变化。因此，需要能够检测甘草中活性成分的分析方法。已有研究表明，梯度洗脱反相 HPLC 法可以作为分离甘草中某些重要化合物的有效方法[2]。本应用报告对经典HPLC 方法和使用新的快速分离高通量(RRHT)色谱柱的 HPLC方法进行了比较。我们用这些 HPLC 技术研究了两种市售甘草根提取物的差异。

实验本研究中所用的两种反相（RP）柱：• 常规的 ZORBAX StableBond (SB)-C18, 4.6 mm x 250 mm，5 µm• ZORBAX SB-C18 RRHT, 4.6 mm x 150 mm, 1.8 µmRRHT 柱填料粒径较小，因此用较短的柱子即可得到与常规长柱相同的分离度，而且可以加快分离速度。

结果HPLC 条件仪器： Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统检测器： 多波长检测器 (MWD)，254 nm/100 BW，450 nm 参比波长流动相： A = 1% 醋酸水溶液B = 1% 醋酸乙腈溶液ZORBAX SB-C18 柱的梯度条件：常规： 4.6 mm x 250 mm，5 µm5% 到 100% B 50 分钟RRHT: 4.6 mm x 150 mm，1.8 µm5% 到 100% B 30 分钟流速： 1.0 mL/min温度： 室温标准样品： 购自 Sigma Aldrich• (G) 0.1 mg 甘草酸铵盐，纯度~75%，溶于 0.5 mL 流动相 B，并加 0.5 mL 流动相 A 至 1.0 mL• (GA) 0.1 mg 18-ß-甘草次酸，纯度 97%，溶于 0.5 mL 流动相 B，并加 0.5 mL 流动相 A 至 1.0 mL样品：• 甘草提取物 A (HERB FARM)• 甘草提取物 B (纽瓦克天然食品)两种提取物都经涡旋混合，并于进样前过滤 (0.2 微米)。进样量： 5 µL 提取物

一般甘草提取物中最重要的化合物是 G，其次是其水解产物GA。这些物质都有商品出售。虽然甘草中也有其它组分被鉴定出来，并有商品出售，但都相当昂贵。因为我们的主要目的是说明使用高分离度 HPLC 短柱的*性，所以在开始建立方法时我们只用了两种标准品（G 和 GA）。图 2a 为 G 和 GA 在常规柱（ZORBAX SB-C18，4.6 mm x 250 mm，5 µm）上梯度分离的结果。待检测的甘草提取物成分非常复杂，所以用等度条件并不能分离所有组分。因带糖基的 G 极性更大，先被洗脱，而GA 远在其后被洗脱。采用该梯度，GA 在 42 分钟出峰。切换到较短的 ZORBAX SB-C18 RRHT 柱（4.6 x 150 mm，1.8 µm）上后，分离效果相同，如图 2b 所示，但分离时间仅为 25 分钟，节省了 40% 左右的时间。

图 3 和图 4 显示了这两种色谱柱对实际甘草提取物的分离情况。按实验部分所述，对过滤后的提取物进样，得到复杂的色谱图。图 3a 显示用粒径 5 µm、长 250 mm 的色谱柱得到的复杂色谱图。截图显示提取物中有少量 GA 存在。GA 是 G 的水解产物，因此其在甘草提取物中的浓度应低得多，除非为了增加水解产物的浓度将提取物进行处理。从峰面积计算可知，提取物 A中 GA 浓度不到 G 的 0.5%。虽然实际的峰数没有计算，但 5 µm 柱的计算峰容量（3）应为290 (分离度= 1.0)。用粒径 1.8 µm、长 150 mm 的色谱柱分离同样的提取物 A，可以看到色谱图分得更好（即分离度更高）（图 3b）。这一高柱效色谱柱的计算峰容量为 442，比用 5 µm 长的色谱柱高 50%。因此，在快速分离短柱上，更容易测定微小组分。计算得到 1.8 µm 柱单位时间的峰数（分离度= 1.0）为17.7 个峰/分钟，而 5 µm 柱仅为 7.1 个峰/分钟。图 4a 和 4b 显示用提取物 B 进行的类似分离。该提取物比提取物 A 更为复杂，将图 3b 的高分离度色谱图与 4b 进行对比。同样，计算的 1.8 µm 每分钟峰数值远远高于 5 µm 柱(分别为17 和 7.5)。根据峰面积计算可知，提取物 B 中 GA 约为 G 的1%。

结论尚未对甘草提取物中的组分进行定量分析。从我们的研究中可知，1.8 µm 柱的分离度和通量远远超过了 5.0 µm 常规柱。当遇到天然产物的更复杂样品时，分析人员需要更精细的组分分析，高分离度、小粒径色谱柱的使用将会越来越多。研究甘草、其它天然产物和中草药时，都需要进行梯度分离和高灵敏度检测。