用高分辨离子阱 LC/MS 对人参皂甙进行结构解析

摘要有历史记载以前，人们就已经开始用草药提取物治疗疾病。通过多少代人的临床经验和教训逐渐发现了其在人体中的活性和作用。中药（TCM）就是一个很好的例子。天然来源的西方药物由于其潜在价值，也越来越受到重视，但是要建立西药的质量控制标准，需要对天然产物的药用成分进行深入了解。本应用报告报导了用 Agilent1200 系列高分离度快速液相色谱系统结合快速分离高通量（RRHT）柱分离复杂的人参提取物中各组分的方法。用离子阱 MSn 和 MRM 获得的信息确定各组分的结构，并用于质量控制。

前言有历史记载以前，世界各地的所有古老文明都曾经用植物和动物源性粗提物治疗疾病。几百年的临床经验和教训使人类逐渐发现了其治疗不同疾病的活性以及对人体的其它作用，这些宝贵的经验世代相传。中药（TCM）是这一经验不断积累、优 化 过 程 的 最 好 例 证 。人 参 （Panaxspecies）是一种使用了 5000 多年的著名亚洲草药。已有报导的人参药理作用包括，对中枢神经系统（CNS）的刺激和抑制作用、抗高血压、抗高血糖、抗癌和免疫调节等作用 5。其主要活性化合物人参皂甙属于三萜皂甙，目前已分离和鉴定出了 80 多种。过去 30 年来，在建立分析人参提取物和制剂的分析方法方面，人们已经做了大量工作。分析人参等复杂天然产物提取物的方法，是高效液相色谱法(HPLC)[1]。现在也采用 LC/MS 仪器测定复杂的和结构相似的人参皂甙，如用LC/ESI oaTOF 进行精确质量测定，用LC/离子阱或 LC/三重串联四极杆质谱仪，通过 MS/MS 和 MSn 进行结构解析[2]。特别是可以用离子阱 MSn 碎片轮廓谱确证药用人参产品的可信性及其活性成分之间的差异[3]。

本应用报告将报导，用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统与 1.8 µm色谱柱分离复杂人参提取物中的各组分。用离子阱 MSn 和 MRM 得到的信息测定各组分结构并用于质量控制。在本系列应用报告的第 I 部分已经报导了高分离LC 系统与 ESI oaTOF 精确质量测量的应用[4]。

实验部分仪器• 带脱气机的 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵。该泵能够用于 1.8 µm 粒径 RRHT色谱柱的高分离度 HPLC 分析，并获得最佳性能• 带温度控制的 Agilent 1200 系列 SL 高效自动进样器。该自动进样器是为Agilent 1200 系列 SL 型二元泵确保低延迟体积而特别设计的• Agilent 1200 系列柱温箱 (TCC)。该TCC 将与 Agilent 1200 系列 SL 型二元泵和可选件分离式热交换器，以及柱后冷却一起使用，在优化的延迟体积条件下，用可选件 2 位/10 通阀进行交替色谱柱再生• Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器 (DAD)。该 DAD 能以高达 80 Hz 的采样速率收集数据。万一网络出现问题，仪器将启动内置的数据存储功能• Agilent 6330 离子阱 LC/MS。该离子阱配置标准 ESI 源，能以 26000 m/z /秒的速度扫描。可以数据依赖地全自动获取 MSn 图谱• 仪器控制所用的软件是化学工作站B01.03，离子阱软件 5.3，用离子阱数据分析软件 3.3 分析数据• 色谱柱：ZORBAX SB-C18，2.1 x 150 mm，1.8 µm样品粉碎的冻干人参 (1g) (Panax ginseng)加入 10 mL 甲醇，超声处理 30 分钟，过滤后直接分析。Agilent 6330 离子阱 LC/MS 系统的设置如图 1 所示。Agilent 1200 系列 SL 型二元泵用 0.17 mm 内径不锈钢毛细管与Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样器(ALS SL)相连。为减少延迟体积，ALS SL的针座毛细管内径为 0.12 mm。同样类型的毛细管连接 Agilent 1200 系列柱温箱中的低延迟体积(1.6 µL)热交换器，柱温箱连接色谱柱。Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器中内置 2 µL 流通池进行UV 检测。出口毛细管直接连接到 6330离子阱 LC/MS 电喷雾源的雾化器上，该仪器能以 26000 m/z/秒的速度进行扫描。优化仪器设置以获得最大分离度，对人参（Panax ginseng）复杂天然产物提取物进行的 UV 分析证明了这一点。为了验证其性能，对 Agilent 1100 系列 LC 系统（5µm 粒径柱）和 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统（1.8 µm 粒径柱）的分析进行了比较[4]。在 220 nm 波长下获得的 UV 色谱图清楚地表明，Agilent1200 系列高分离度快速液相色谱系统的色谱峰分离度更高。UV 色谱图中大多数基线分离峰的峰宽 (FWHM) 小于 0.1 分钟。高分辨配置的 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统的全部性能在另一篇应用报告中报导[5]。该系统稍加改动也可以用于高通量分析，这在另一篇应用报告中有详细报导[6]。

方法• Agilent 1200 系列 SL 型二元泵的操作条件如下：溶剂 A： 水 + 0.1% TFA溶剂 B： 乙腈 + 0.1% TFA流速： 0.5 mL/min梯度： 0 分钟 5% B,1 分钟 5 % B,60 分钟 85 % B,61 分钟 95 % B,70 分钟 95 % B

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停止时间： 70 分钟后运行时间：15 分钟• 用 Agilent 1200 系列 SL 型高效自动进样 器 进 样 10 µL 样 品 ，样 品 冷 却 至10 ºC。1 分钟后样品定量管切换到旁路，以缩小延迟体积• Agilent 1200 系列 SL 型柱温箱调节到50 ºC，配置低延迟体积热交换器• 用 Agilent 1200 系列 SL 型二极管阵列检测器以 80 Hz 在 220 nm/4 nm 波长（参比 360/100）下采集数据，配置 2µL 流通池，30 mm 光程• 6330 离子阱 LC/MS 在下列条件下操作：离子源： ESI 正离子模式干燥气： 5.0 L/min干燥温度： 300 ºC雾化器： 15 psi靶标： 125000最长累加时间： 100 ms扫描： 200-1300平均： 2MSn： 自动化 MS/MS 和 MS3

结果与讨论在高分离度 HPLC 上用 1.8 µm 粒径色谱柱对人参粗提物中各组分进行分离后，再使其碎裂进行 MSn 分析。主要成分在 20到 33 分钟之间洗脱，在基峰色谱图中标为人参皂甙 Re、Rf、F11、Rb1、Rb2、Rc、Rd（图 2）。所用色谱柱的高分离度使人参提取物中大量微量化合物得到了分离，由于扫描速度高达 26000 m/z/秒，足够采集离子阱 MS/MS 和 MSn 数据，因此这些小峰也可以被分析。本应用深入研究了 人 参 皂 甙 Re、Rb1 和 Rc 的 离 子 阱MS/MS 和 MS3 数据，用于结构解析，而品种依赖的 Rf 和 F11 人参皂甙分析在另一部分中讨论[7]。图 1Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统与 MS 联用，采用低延迟体积配置95 5989-4705EN简单 MS 扫描得到质子化和加合形式的分子离子质量（图 3）。质子化和加合离子的比值取决于电喷雾离子源的温度，因为加合复合物在高温下比质子化离子更稳定，后者将发生裂解，丢失一个水和其它碎片。人参皂甙 Re 质谱扫描产生的离子有 m/z 928.9 [M+H-H2O]+、946.9[M+H]+、969.1 [M+Na]+；人参皂甙 Rb1产 生 的 离 子 是 m/z 1090.1 [M+HH2O]+、1108.5 [M+H]+、1131.1 [M+Na]+；人参皂甙 Rc 则得到离子 m/z 1059.71[M+H-H2O]+、1077.75 [M+H]+、1101.1[M+Na]+。 选 择 6330 离 子 阱 质 谱LC/MS，MS/MS 和 MS3 条件产生加合离子。与质子化离子相比，这些离子的裂解能得到更清晰、更多的结构信息，其碎片与本研究第 I 部分讨论的 CID 碎片相似[4]。