采用安捷8800电感耦合等离子体串联质谱仪测定多肽和磷酸肽

结合毛细管液相色谱分离技术，Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪 在 MS/MS 质量转移模式下可痕量测定磷酸肽中的磷与含硫多肽中的硫。使 用 LC-ICP-MS 可获得含硫和含磷物质的绝对检测限（分别为 11 fmol 和 6.6 fmol）。硫的同位素比值测定结果与其理论值高度吻合，从而证 明干扰得以有效消除。所观测到的硫和磷的峰形和信噪比表现优异。测定结果 表明 capLC 与 ICP-MS/MS 联用技术在使用非特殊标样测定含硫和含磷多肽的 高灵敏度和同时绝对定量分析方面有巨大潜力。

LC-MS/MS 用于定量分析制药/生物制药和临床研究中的 目标蛋白质。此方法常常使用同位素标记的合成蛋白质和 多肽作为内标来定量分析相应的目标化合物。与之相反， LC-ICP-MS 通过测定目标化合物中含有的杂原子硫和磷对 蛋白质和多肽进行非特异性定量分析。通过这种方式可以 使用含有杂原子的不同化合物，并将单个含杂原子的非蛋 白质化合物作为通用标样对其进行定量。不幸的是，硫和 磷的检测限因其高电离能和单四极杆 ICP-MS (ICP-QMS) 的多原子干扰而大打折扣——即使使用了碰撞/反应池 (CRC)。虽然扇形磁场高分辨 ICP-MS (HR-ICP-MS) 也被用 于该类应用，但迄今为止仍没有任何 ICP-MS 仪器能够达 到已报道的 ESI-MS/MS 仪器使用同位素标记合成多肽时 所具有的检测限（特别是对于硫）。表 1 列出了关于 LCICP-MS 对于硫和磷检测限的已发表数据，包括所用的 ICPMS 技术和分离技术。在这项工作中，我们采用了 Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪（也简称为 ICP-MS/ MS）通过对硫和磷杂原子进行绝对定量分析来测定蛋白质 和多肽。

较之传统的仪器或 ICP-MS，Agilent 8800 在八极杆反应 池 (ORS3 ) 和四极杆质量过滤器 (Q2) 前方配备了额外的主 四极杆质量过滤器 (Q1)。在该串联质谱结构中，Q1 作为 单位质量过滤器仅允许目标分析物质量数的离子进入反应 池，排除了所有其他离子。因为等离子体和基质中的离子 被 Q1 排除，确保了即使在复杂高基质样品中，ORS3 中的 反应过程也能得到精确控制从而实现准确测量，并且灵敏 度也得到了极大的增强。色谱分离过程通过与 8800 ICPMS/MS 联用的安捷伦 cap-LC 系统完成。

实验 试剂和材料 超纯水（Millipore，东京，日本），HPLC 和分析试剂级乙 腈以及甲酸（Wako Pure Chemical，Ltd.，大阪，日本）。 ICP-MS 标准品（SPEX CertiPrep，Inc.，Metuchen， NJ，美国）、对硝基ben酚磷酸二酯（BNPP，纯度 99%） 和蛋氨酸（纯度 ≥ 99% 82）（Sigma Aldrich，Steinheim， 德国)。磷酸肽标准品的氨基酸序列为 LRRApSLG 和 KRSpYEEHIP，含硫多肽标样为 ACTPERMAE 和 VPMLK。 所有多肽购自 AnaSpec（Fremont，CA，美国），纯度 都 ≥ 95%。

制备含硫和磷的标样 使用 BNPP 和蛋氨酸在 1% 流动液相 B 基质中（这是液 相色谱梯度淋洗的起始条件）制备 0、25、50、100 和 200 ng/mL（以硫、磷元素浓度计）的含硫和磷的校准标样。 磷酸肽溶液的制备 分别配制三份溶液（100 ng/mL，以磷元素浓度计） 以确定每个多肽的保留时间和纯度。溶液 1 包含 LRRApSLG 和 ACTPERMAE，而溶液 2 包含 KRSpYEEHIP 和 VPMLK。 两种溶液中均包含大约 100 ng/mL BNPP 和蛋氨酸。将溶 液 1 和 2 按重量法 1:1 混合配制成 3

仪器

capLC 系统 Agilent1200 系列，采用 Agilent Zorbax SB C18, 5 µm, 150 x 0.3 mm 反相毛细管色谱柱的。流动相 A 和 B 分别包 含水和乙腈。两种流动相都含有 0.1% 甲酸和 10 ng/mL 锗 （作为 ICP-MS 内标使用）。进样量为 1-2 µL。液相色谱流 速为 5 µL/min，液相色谱梯度淋洗条件如下：0-3 分 钟：1% B，等度；3-35 分钟：1-60% B，线性梯度。 Cap LC-ICP-MS 接口 使用安捷伦 capLC 接口（安捷伦 G3680A 毛细柱液相色 谱接口套件，图 1）将 capLC 色谱柱连接到 ICP-MS，此 capLC 接口结构为一个小的石英雾化室内包含一个消耗型 的雾化器。

ICP-MS 使用 Agilent 8800 电感耦合等离子体串联质谱仪。以 80 mL/min 的流速从雾化气通道通入氧气（氩:氧比例为 8:2） 到雾化器气体中。池气体：氧气，流速为 0.35 mL/min。 样品流速：5 µL/min。31 P、32 S 和 34 S 的积分时间 150 ms （每个峰值一个点）。使用配于 30% 的乙腈中 100 ng/mL 磷 和硫的标样对 8800 进行优化，以满足低的磷、硫检出限 要求，流速为 5 µL/min，注射泵进样。使用Agilent ICP-MS MassHunter 软件进行液相色谱操作和对色谱峰进行积分。

在 MS/MS 模式下使用 Agilent 8800 消除对硫和磷的干扰 8800 在 MS/MS 质量转移模式下操作以消除对硫和磷的干 扰。在图 2 中，上方的示意图 (a) 将 Q1 设为 m/z = 32， 从而允许 32 S + 进入反应池，排除了其它质量数的干扰 （包括质荷比为 48 的离子）。S+ 在池内通过与氧气反应转 换为 SO+。Q2 设置为 m/z = 48，从而允许 SO+ 进入检测 器，排除了 m/z = 32 的所有原始质量数干扰物。m/z = 48 的干扰物在碰撞反应池之前已由 Q1 排除。这是 MS/MS 结构具有强大消干扰能力的关键所在——实现了在可控条 件下进行准确无干扰的反应物离子测量。

2 下方的示意图 (b) 显示了对磷的测定设置：Q1 设置 为 m/z = 31，从而允许 31 P+ 通过，排除了其它质量数的 干扰（包括 m/z = 47）。31 P+在池内通过与氧气反应转换 为 PO+。Q2 设置为 m/z = 47，从而允许反应产物 PO+ 进 入检测器。m/z 47 = 处的干扰物在碰撞反应池之前已 由 Q1 排除。Q1 消除的干扰物包括：（m/z = 47 处 47 Ti +、 32 S14 NH+、32 S15 N+、15 N16 O+、12 C35 Cl + 对 31 P16 O+ 的干扰， 以及 m/z = 48 处 48 Ti +、36 Ar 12 C+、P16 OH+、31 P17 O+、 48 Ca+对 SO+的干扰），Q2 消除的干扰物包括：（15 N16 O+、 14 N16 OH+、14 N17 O+、12 C18 OH+对 31 P+的干扰，以及 16 O+、 15 N17 O+、15 N16 OH+、14 N18 O+ 对 32 S+ 的干扰），如各图中 所示。

……

结论 对蛋白质中天然存在的 ICP-MS 可检测元素进行高灵敏度和 无干扰的定量检测将扩展 LC-ICP-MS 方法在蛋白质组学中 的应用。通过与 cap-LC 分离方法联用，Agilent 8800 电 感耦合等离子体串联质谱仪利用 LC-ICP-MS 分析含硫和磷 物质时可获得低检测限（分别为 11 fmol 和 6.6 fmol）。 在 MS/MS 质量转移模式下操作时，Agilent 8800 通过使 分析物与氧气反应并测量产生的氧化物离子，从而有效消 除了对磷和硫的干扰。硫的同位素比测量值与理论值吻合 良好，证明硫干扰物得以有效消除，并且由于串联质谱模 式能保留正确的同位素模式，可以通过同位素稀释法来校 正因梯度淋洗导致的硫灵敏度的变化。 所测得的含硫和磷物质及多肽的峰形和信噪比佳。这也是将通用标样应用于多肽和磷酸肽的同步绝对定量分析。 这种全新的功能强大的硫磷（特别是硫）检测法将使 LCICP-MS 在诸多领域中得到应用：如药物研究（药物和代 谢物）、环境分析（农药）和纳米技术（工程纳米颗粒的 表征）